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Western Blot内参选择
发表时间:2017-03-25 22:30

  要检测一个基因的表达产物是否正,或者比达产物量的相对变化,首方法是Western Blot。因Western Blot操作相对简单方便,既可以定性分析表达产物,同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。    

       然,利的候Western Blot做起来很简单,可不候也很令人心――做不出、假果出多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦„„竟,作有活性的生物大分子,抗体和抗原的反不象1+1那,而用这种定的试剂定同知之甚少的表达产物,确实是有一定的不定性的。所以,严谨的 Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系,对实验结果分析是非常有用。特是当实验现问题时,借助参照体系很容易就可以问题所在,而不必抓耳腮怨天尤人。    

       良好的参照体系通常包括分子量Marker(用来定蛋白条带对应的分子量大小)、空白照(如果是诱导体系还应该诱导前的照)、已知量物的正照,有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因,国内的不少人做Western Blot往往省略参照,果出现问题时无法分析果,即便有果也可能影响结果的分析。  

       内参即是内部参照(Internal Control),于哺乳胞表一般是指由管家基因编码的蛋白(Housekeeping Proteins),它在各组织胞中的表恒定,在检测蛋白的表水平常用它来做参照物。在WesternBlotting 实验中,除了需要行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、膜、蛋白抗体孵育、色等步骤以外,需要行内参的检测,以校正蛋白定量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准性。  

       实际上内参是最容易被忽略的一。我知道,要用Western Blot 比不同条件下或者不同组织中,目的蛋白表量的相多少,前提条件是等量的胞上,才有比的基,特量不高,上量的差就很可能影响结果的分析,所以需要内参。在国外表的文章中,Western Blotting 实验结须进行内参校正已成种惯例。但是,国内仍有不少科研人在Western Blotting实验中忽略了内参的使用,将蛋白定作为规范需相互比的各种样量等同的唯一方法。  

       然而各蛋白质浓度定量方法,都存在局限性,不能完全准定各种样品的蛋白度。如UV法直接定量,测试较纯净、成分相对单一的蛋白,相于比色法来,操作简单,但是容易受到平行物如DNA的干,且敏感度低,要求蛋白的高。比色法定蛋白度一般有BCA、Bradford、 Lowry 等几方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白以及去污剂的干。Bradford法敏感度最高,且与一系列干Lowry、BCA 反(如DTT,基乙醇)相容,但是污剂依然是敏感的,其最主要的缺点是不同的准品会致同一品的果差异较大,无可比性。外,蛋白定量以后需要等量上,此步骤也存在操作差。在Western blotting实验时使用内参,即可便地定量和上样步骤产生的行校正。    

       在Western Blotting中使用内参其就是在WB程中外用内参对应的抗体检测内参,这样检测目的物的同可以检测内参的表,由于内参在各组织胞中的表恒定,借助检测每品内参的量就可以用于校正上样误差,这样半定量的果才更可信。此外使用内参可以作空白照,检测蛋白膜情况是否完全、整个Western Blot色或者光体系是否正常。    

       在Western Blotting实验过程中使用内参的方法通常有以下三。    

       第一是超级简便的标记内参使用法,只要在二抗孵育加入HRP标记内参抗体,按照正常操作即可;    

       第二是普通内参,当目的蛋白的分子量大小与用的内参蛋白分子量相差不大,可以先行目的蛋白的抗体温育色和检测,然后使用Strip冲液洗掉膜上的抗体,重新行内参蛋白的抗体温育、检测。    

       第三,当目的蛋白的分子量大小与用的内参蛋白分子量大小相差比情况下,可以在膜后染,根据蛋白Marker的大小将膜剪大分子量和小分子量部分,使内参蛋白与目的蛋白分,然后两块膜分与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体行温育,二抗温育以及色。    

       常用的蛋白内参有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此要知道你检测的蛋白的分子量来选择的内参!    

       actin即肌蛋白,是胞的一重要骨架蛋白。actin大致可分,其中四是不同肌肉组织性的,包括alpha-skeletalmuscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smoothmuscle actin,其余两种广泛分布于各种组织中,包括beta-actin(β- non-muscle)和gamma-non-muscle actin。些不同的组织分布是不一的,在肌肉组织中的beta-actin分布就很少,心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参,不能一概而的。beta-actin作内参是得到了公的,针对大多数组织胞来的,它广泛分布于内,表量非常富。尽管最近有一些文章已经开疑beta-actin作内参的有效性(好像是于上量>20ug的蛋白区分能力下降,不清楚了),但是文章应该还是没有问题的。至于其他的内参也是可以考用的,GAPDH(甘油-3-酸脱氢酶)是参与糖酵解的一种关键酶,而tubulin和actin似,是胞骨架的成部分,但是不是肌肉的主要成分,应该是一个代替品。三时发化的情况很少,需要具体分析。一旦出上述三内参同时发化,如果是蛋白可以用胞核的内参如PCNA,TATA-box bingding protein(TBP)甚至线粒体的内参来代替,当然一般这种可能性出的几率微乎其微。    

       不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白,很多抗体不出条未必是抗体量的问题。很多公司的内参抗体是用抗原片段制的,不同的公司选择的片段不一。以最常用的beta-actin例,有的公司选择N-端,有的选择C-端。用N- 端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作抗原制抗体(抗和多抗)的占大多数,主要有santacruz(Cat#sc-69879),sigma(Cat# A1978等),ProSci(Cat#3779),Cell Signaling(Cat#4967),AxxoraPLATFORM(BET-A300)等,这类抗体均不能检测心肌和横肌中的actin条用C-端16aa短抗原制抗体的主要有Axxora PLATFORM(PSC-3777),EPITOMICS(1784-1,1854-1等),这类抗体可以在肌肉胞中检测到actin性信号。有候在实验检测内参时产生“组织性”,就是由于抗体选择造成的。  

       actin种异构体存在组织分布特性,不同型actin之具有高的序列相似性(>90%)。β-actin是分布于非肌胞中的一骨架蛋白,选择作β-actin内参首先得保组织广泛表的(尤其是做蛋白的组织达谱时)。那β-actin抗体的抗原应该用与actin其它异构体一致的基酸序列。公司制抗体是用beta-actin的某一段小短免疫原,可能会因为选取的短在不同型actin之保守与否,而致所制抗体具有一定的组织性.如取的短肽仅在beta型存在,所得抗体就检测非肌胞中的actin,而取的短在六型中均存在,此抗体除非肌胞外,可以检测cardiac,skeletal,smoothmuscle胞的actin。


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