新闻详情
五分钟速成!二抗选择最全攻略Get
发表时间:2017-04-01 00:06来源:五分钟速成!二抗选择最全攻略Get | 每日生物评论网址:http://www.bio-review.com/antibody-choose/

  当你想花最多5分钟来选择二抗时,过程总是另你措手不及。 结合物、F (ab’)2片段、亲和纯化、轻链特异性。。。可选择性似乎太多了。不要紧,小编和你一起梳理下二抗的各种形式和类型。

  通常二抗都会结合到某个分子上,以方便检测到二抗(因为一抗大多数都直接和某个抗原片段结合,直接检测很困难)。

酶标二抗

  二抗常与一些酶如过氧化物酶(通常为辣根过氧化物酶,HRP)或碱性磷酸酶(AP)结合。将二抗与合适的底物孵育可以产生颜色或光以检测预期的蛋白。比色测定通常用于免疫组织化学(IHC/ICC)或ELISA,而发光底物则用于Western印迹。

生物素标记二抗

  生物素(Biotin)标记的二抗通常用于扩增信号并增加检测的灵敏性,链霉亲和素(Streptavidin, SA)与Biotin特异性结合,形成SA-Biotin系统可偶联抗原、抗体、报告酶、寡核苷酸分子及荧光物质,广泛用于生物反应检测系统。

多聚复合物标记二抗

  一些公司研发出多聚复合物标记的二抗和相关的检测试剂盒。将多聚复合物标记在二抗上,形成类似于章鱼的超大抗体-酶复合物,其巨大的复合物所含分子量远高于常规复合物标记的抗体,更加灵敏和高特异性。强大的组织细胞渗透力及信号放大能力,特别适合应用于IHC及其它需要放大信号的ELISA,蛋白质印迹等。

荧光标记二抗

  荧光标记的二抗与荧光染料结合,通常用于流式检测(FC),细胞或组织中蛋白质的免疫荧光检测(IF)。最近,也应用于Western印迹分析的CCD检测。几种不同颜色的荧光染料可用于允许同时检测多种蛋白(双标或三标)。常用的荧光染料除了经典的AMCA、FITC、Cy3等,目前市面上顶尖的的IFKine、Dylight、Alexa Fluor已然已经成为科研工作者的新宠。详见http://www.abbkine.com/?s=IFKine&post_type=product&submit=

  选择二抗的第二个因素是:根据一抗的动物来源和抗体类型(类和亚类)来确定。

动物来源

  二抗必须能识别一抗。如果一抗是小鼠单克隆抗体,分离类型是小鼠IgG1,那么二抗必须选择抗小鼠IgG的抗体;同样,如果一抗来源于山羊,二抗必须选择抗山羊的抗体。

类和亚类

  二抗还必须对应一抗的类和亚类。尤其是一抗是均质的单克隆抗体时,这点 特别重要。例如,一些一抗分离类型是小鼠IgM,而有一些是IgG。购买二抗时注意分别选择抗小鼠IgM和小鼠IgG的抗体。 小鼠IgG抗体还可以分为各种亚类,如IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG2c,IgG3。虽然可购买能识别所有亚类的一般的抗小鼠IgG二抗,但尽可能购买抗某一特定亚类的抗体以增加特异性。大多数物种的分离类型都是IgG,物种特异性抗IgG抗体能很好地工作。但注意鸟类或禽类的免疫球蛋白为IgY。

IPkine

抗重链或轻链二抗

       Ig分子的基本结构是由四肽链组成的。即:由二条相同的分子量较小的肽链(轻链,Light chain)和二条相同的分子量较大的肽链(重链,Heavy chain)组成。抗原识别结构域为Fab片段。 Fab片段是高度可变的,说明抗体抗原的特异性。每条重链和轻链还含有称为保守区的非可变区或称Fc片段。 可以购买仅识别特定部分(重链或轻链)的二抗。

  最常见的二抗类型是同时可以抗重链和轻链的抗体,表示方式为anti-Ig G(H+L)。在免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)和免疫共沉淀(co-Immunoprecipitation, co-IP) 实验中,常常因为有限的一抗,IP和WB的操作过程中而不得不用到相同的一抗或同种属来源的一抗,这种情况下,如果使用常规的Anti-IgG(H+L)二抗,WB实验中IP抗体变性后产生的重链(55kDa)和轻链(25kDa)都能够识别,而此非特异的信号往往会部分甚至完全掩盖目的蛋白的信号,影响实验结果。如果目标蛋白分子量小于30Kda,为了避免抗体轻链的干扰,推荐您使用重链特异性的二抗。如果您的目标蛋白分子量大于30Kda,为了避免抗体重链的干扰,推荐您使用轻链特异性的二抗。

F(ab’)2或Fab形式二抗

  在IHC或ICC实验中,有些细胞或组织表面Fc受体较多,为避免二抗与Fc受体非特异性结合,导致高背景,F(ab’)2形式的二抗是更好的选择。另外,F(ab’)2形式的二抗,其分子本身较小,更容易渗透到细胞、组织内,灵敏度更高。单价的Fab二抗只有一个结合位点,可以用来封闭免疫双标实验中同一物种来源的两种一抗。能有效的解决IF双标实验中,两个一抗来自同一种属时的困境。

亲和纯化二抗

  抗体纯化的目的是增加抗体的特异性,需要亲和纯化的抗体通过含有目标抗原的柱子。因此,它们通常能最大限度的减少非特异性结合。另外,亲和纯化后的抗体是高亲和力抗体,可用于检测低丰度的蛋白。

经血清吸附的二抗

  一些二抗通常会经过人或其它动物IgG吸附。这类抗体能减少非特异性结合,特别适合应用于一些免疫检测如IHC。如在IHC实验中,样本来源于人,则可选择经人血清吸附的二抗,以避免二抗和样本发生交叉反应,影响实验结果。

会员登录
登录
我的资料
留言
回到顶部